CULTIVO DE MICOORGANISMO (Capitulo 5)

Cultivo de microorganismos

El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.

NECESIDADES PARA EL CRECIMIENTO

 La mayor parte del peso seco de los microorganismos es materia orgánica que contiene elementos como carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, se necesitan iones inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y cloruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gradientes químicos a través de la membrana celular. Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos los elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de iones para la producción de energía y reacciones catalíticas.

FUENTES DE ENERGÍA METABÓLICA

 Los tres mecanismos principales para la generación de energía metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. Para el desarrollo del microorganismo debe utilizarse al menos uno de estos mecanismos.

• Fermentación

La fermentación se caracteriza por la fosforilación del sustrato, un proceso enzimático en el cual los enlaces de pirofosfato se donan directamente al trifosfato de adenosina (ATP) por un intermediario metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado se forma por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermentación como la glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se acompaña de cambios en el estado general de oxidación-reducción del sustrato fermentable y por tanto la composición elemental de los productos de fermentación debe ser idéntica a la de los sustratos.

• Respiración

 La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento dependientes de energía para descargar una batería. La reducción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través de una serie específi ca de transportadores de electrones en la membrana establece la fuerza motriz protónica a través de la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones) puede ser un compuesto orgánico o inorgánico: por ejemplo, el ácido láctico actúa como reductor en algunos microorganismos, en tanto que el gas hidrógeno es reductor para otros.

• Fotosíntesis

La fotosíntesis es similar a la respiración en el sentido de que la reducción de un oxidante a través de una serie específi ca de transportadores de electrones establece una fuerza motriz protónica. La diferencia en los dos procesos consiste en que en la fotosíntesis se crean el reductor y el oxidante por medios fotoquímicos por medio de energía luminosa absorbida por los pigmentos en la membrana; así, la fotosíntesis continúa en tanto exista una fuente de energía luminosa. Las plantas y algunas bacterias son capaces de invertir cantidades sustanciales de energía luminosa para hacer del agua un reductor para el dióxido de carbono. El oxígeno participa en este proceso y se produce materia orgánica. La respiración, la oxidación favorable desde el punto de vista energético de la materia orgánica por un aceptor de electrones como el oxígeno puede proporcionar a los microorganismos con capacidad de fotosíntesis energía en ausencia de una fuente luminosa.

NUTRICIÓN

 La nutrición en medios de cultivo debe contener todos los elementos necesarios para la síntesis biológica de un nuevo microorganismo. En la siguiente revisión, los nutrientes se clasifican con base en los elementos que proporcionan.

• Fuentes de carbono

 Como se mencionó antes, las plantas y algunas bacterias son capaces de utilizar energía de fotosíntesis para reducir el dióxido de carbono a expensas del agua. Estos microorganismos pertenecen al grupo de microorganismos autótrofos, seres vivos que no necesitan nutrientes orgánicos para su desarrollo. Otros microorganismos autótrofos son los quimiolitótrofos, que utilizan sustratos inorgánicos como hidrógeno y tiosulfato como reductor y dióxido de carbono como fuente de carbono. Los microorganismos heterótrofos, para su desarrollo, requieren carbono orgánico que debe encontrarse en una forma que puedan asimila.

• Fuentes de nitrógeno

 El nitrógeno es un constituyente importante de las proteínas, ácidos nucleicos y otros compuestos, y constituye casi 5% del peso seco de una bacteria típica. El nitrógeno inorgánico molecular (N2), es muy prevalente pues constituye casi 80% de la atmósfera terrestre. Es un compuesto muy estable, principalmente porque se requieren altas cantidades de energía de activación para romper su triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Sin embargo, éste puede proporcionarse en diversas formas y los microorganismos varían en cuanto a su capacidad para asimilarlo.

La capacidad de asimilar N2 en forma reducida como NH3, proceso denominado fi jación de nitrógeno, es una propiedad singular de las células procariotas y muy pocas bacterias son capaces de desdoblar el triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Este proceso necesita grandes cantidades de energía metabólica y se desactiva con facilidad por el oxígeno.

• Fuentes de azufre

 Al igual que el nitrógeno, el azufre es un componente de muchas sustancias orgánicas de las células. Forma parte de la estructura de varias coenzimas y se encuentra en las cadenas laterales de cisteinil y metionil de las proteínas. El azufre en su forma elemental no puede utilizarse por plantas o animales. Sin embargo, algunas bacterias autótrofas pueden oxidarse a su forma de sulfato (SO4 2−). La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar sulfato como fuente de azufre, al reducir el sulfato al nivel de ácido sulfh ídrico (H2S). Algunos microorganismos pueden asimilar H2S directamente del medio de cultivo, pero este compuesto puede ser tóxico para muchos de ellos.

• Fuentes de fósforo

 El fosfato (PO43−) es necesario como componente del ATP, ácidos nucleicos y coenzimas como NAD, NADP y fl avinas. Además, muchos metabolitos, lípidos (fosfolípidos, lípido A), componentes de las paredes celulares (ácido teicoico), algunos polisacáridos capsulares y algunas proteínas sufren fosforilación. El fosfato siempre se asimila en forma de fosfato inorgánico libre (Pi).

• Fuentes de minerales

 Numerosos minerales son necesarios para la función de las enzimas. El magnesio (Mg2+) y el ion ferroso (Fe2+) también se encuentran en derivados de porfi rina: el magnesio en las moléculas de clorofi la, el hierro como parte de las coenzimas de los citocromos y peroxidasas. Mg2+ y K+ son esenciales para la función e integridad de los ribosomas. El calcio es necesario como constituyente de las paredes celulares de bacterias grampositivas, aunque es indispensable para las bacterias gramnegativas. Muchos microorganismos marinos requieren Na+ para su desarrollo. Durante la elaboración de un medio para el cultivo de la mayor parte de los microorganismos, es necesario proporcionar fuentes de potasio, magnesio, calcio e hierro, por lo general en sus formas iónicas (K+, Mg2+, Ca2+ y Fe2+). Son necesarios muchos otros minerales (p. ej., Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ y Zn2+); éstos con frecuencia pueden suministrarse en agua corriente o como contaminantes de otros ingredientes de los medios de cultivo.

• Factores de crecimiento

 Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe contener la célula a fi n de desarrollarse, pero que es incapaz de sintetizar. Muchos microorganismos que reciben los nutrientes mencionados antes son capaces de sintetizar todos los bloques para la construcción de macromoléculas (fi g. 5-1): aminoácidos, purinas, pirimidinas y pentosas (precursores metabólicos de ácidos nucleicos); carbohidratos adicionales (precursores de polisacáridos) y ácidos grasos y compuestos isoprenoides. Además, los microorganismos de vida libre deben ser capaces de sintetizar complejos vitamínicos que actúan como precursores de coenzimas.

Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza por una secuencia de reacciones enzimáticas; cada enzima se produce bajo el control de un gen específi co. Cuando un microorganismo sufre una mutación genética que da origen a la falla en una de estas funciones enzimáticas, la cadena se rompe y ya no se elabora el producto termina.

FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO

Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrientes necesarios para el microorganismo a cultivar y tales factores incluyen pH, temperatura y aireación que deben ser controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo líquido; al medio de cultivo puede añadirse agar o gel de sílice para que adquiera consistencia de gel para situaciones especiales. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que es singular para el cultivo microbiano por su resistencia a la acción microbiana y porque se disuelve a 100°C pero no forma placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45°C; las células pueden suspenderse en el medio a 45°C y enfriar con rapidez dicho medio de cultivo hasta que adquiera la consistencia de gel, sin lesionar a las bacterias.

• Nutrientes

En general, debe suministrarse lo siguiente:
1) donadores y aceptores de hidrógeno casi 2 g/L;
2) fuente de carbono: casi 1 g/L;
3) fuente de nitrógeno: casi 1 g/L;
4) minerales: azufre, fósforo, casi 50 mg/L de cada uno y oligoelementos, 0.1 a 1 mg/L de cada uno,
5) factores de crecimiento: aminoácidos, purinas, pirimidinas, casi 50 mg/L de cada uno y vitaminas, 0.1 a 1 mg/L de cada uno. La mayor parte de los microbios de vida libre se desarrollan bien en extractos de levaduras; las formas parasitarias pueden necesitar sustancias especiales que se encuentran sólo en la sangre o en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay microbios parasitarios (p. ej., Treponema pallidum) que no pueden cultivarse in vitro o que crecen en el interior de células eucariotas (p. ej., Chlamydia trachomatis).

• Concentración de iones hidrógeno (pH)

La mayor parte de los microorganismos tienen un pH óptimo muy estrecho. El pH óptimo debe determinarse empíricamente para cada especie. La mayor parte de los microorganismos (neutrolófi los) proliferan mejor en un pH de 6.0 a 8.0, aunque algunas formas (microorganismos acidófi los) encuentran su cifra óptima con pH de 3.0 y otros (alcalófi los) tienen un pH óptimo de hasta 10.5.

Los microorganismos regulan su pH interno pese a la amplia gama de cifras de pH externo mediante el bombeo de protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los microorganismos acidófi los mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre un pH externo de 1.0 a 5.0; las células neutras mantienen un pH interno cercano a 7.5 con intervalos externos de pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófi los mantienen un pH interno de casi 9.5 sobre intervalos externos de 9.0 a 11.0.

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• Temperatura

Las diferentes especies microbianas varían ampliamente en cuanto a sus intervalos óptimos de temperatura para su proliferación. Los psicrófi los se desarrollan mejor en temperaturas bajas (15 a 20°C) los mesófi los a 30 a 37°C y los termófi los a temperaturas de 50 a 60°C. Algunos microorganismos son hipertermófi los y pueden desarrollarse a temperatura de ebullición, la cual existe en sitios con alta presión como en las profundidades del océano. La mayor parte de los microorganismos son mesófi los; 30°C es la temperatura óptima para muchas formas de vida libre y la temperatura corporal del hospedador es óptima para simbiontes homeotermos. El extremo superior de las temperaturas toleradas por cualquier especie dada se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie, medidas en extractos celulares. Los microorganismos comparten con las plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la temperatura por arriba de la temperatura óptima de proliferación. Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la temperatura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incremento térmico.

• Aireación

Muchos microorganismos son aerobios obligados, es decir, de manera específi ca necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno; algunos anaerobios son facultativos, es decir, tienen la capacidad de vivir de forma aerobia o anaerobia; en tanto que otros son anaerobios obligados, pues requieren una sustancia diferente al oxígeno como aceptor hidrógeno y son sensibles a la inhibición con oxígeno.

• Concentración iónica y presión osmótica

 En menor grado, deben controlarse factores como la presión osmótica y concentración de sales.   Los microorganismos que requieren concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos, aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se denominan osmófilos.

MÉTODOS DE CULTIVO

Deben considerarse dos problemas: elección del medio de cultivo apropiado y aislamiento de un microorganismo bacteriano.

Medios de cultivo:  La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la naturaleza de la investigación. En términos generales, pueden encontrarse tres situaciones:
1) tal vez sea necesario cultivar un grupo de células de una especie en particular que se encuentran a la mano;
2) puede ser necesario establecer el número y tipo de microorganismos presentes en un material dado,
3) podría desearse el aislamiento de un tipo particular de microorganismo a partir de una fuente natural.

• A.    Desarrollo celular de una especie dada

Podría ser necesaria una gran cantidad de experimentación para establecer las necesidades del microorganismo y el éxito depende de proporcionar una fuente apropiada de cada uno de los nutrientes mencionados al inicio de este capítulo.

• B.     Estudio microbiológico de materiales naturales

 Un material dado puede contener muchos microambientes diferentes y cada uno proporciona un nicho para diferentes especies. El cultivo de una muestra de material bajo cierto grupo de condiciones permitirá que un grupo selecto de formas produzca colonias, pero podría ocasionar que se pasen por alto muchos otros tipos. Por tal razón, se acostumbra cultivar las muestras de mar utilizando diversos medios de cultivo con diferentes condiciones de incubación, según sea posible en condiciones prácticas. No es irracional utilizar seis u ocho medios de cultivo y condiciones de cultivo diferentes si se van a identifi car la mayor parte de las formas presentes. Cada tipo de microorganismo debe tener la posibilidad de proliferar, por lo que se utilizan medios sólidos para evitar el aglomeramiento de colonias. Por otra parte, la competencia evitará que se formen algunos tipos de colonias.

• C.    Aislamiento de un microorganismo en particular

Una pequeña muestra de tierra, si se manipula de manera apropiada, permite el cultivo de diferentes tipos de microorganismos en cada microentorno presente. Para la tierra fértil (húmeda, aireada, rica en minerales y material orgánico) esto signifi ca que pueden aislarse cientos o incluso miles de tipos bacterianos, lo cual se lleva a cabo al seleccionar el tipo deseado. La transferencia de una muestra de este cultivo a un medio fresco dará origen a un enriquecimiento adicional de las azobacterias; después de varias transferencias seriadas el cultivo puede colocarse en un medio de cultivo sólido enriquecido, lo que permite el aislamiento de colonias de azobacterias. El medio líquido se utiliza para permitir la competencia y por tanto la selección óptima, incluso cuando el tipo deseado es representado en la tierra por sólo una pequeña cantidad de células en la población de millones. Pueden obtenerse ventajas del “enriquecimiento natural”. Por ejemplo, al observar oxidantes de queroseno, se elige tierra contaminada con aceite, porque éste es un medio ya enriquecido para tales formas bacterianas.

El enriquecimiento de cultivos es un procedimiento por medio del cual se prepara el medio de cultivo para duplicar el ambiente natural (“nicho”) del microorganismo deseado, por lo que se permite su selección. Un principio importante involucrado en tal selección es el siguiente: el microorganismo seleccionado será del tipo del cual se han satisfecho sus necesidades nutricionales. Por ejemplo, las azobacterias crecen en un medio de cultivo que contiene nitrógeno orgánico, pero sus necesidades mínimas consisten en la presencia de N2; por tanto, se elige un medio de cultivo que contenga N2 como la única fuente de nitrógeno. Si se añade nitrógeno orgánico al medio de cultivo, las condiciones ya no serán selectivas para azobacterias, sino que serán para formas para las cuales el nitrógeno orgánico es una necesidad mínima.

Aislamiento de microorganismos en cultivos puros

 A fin de estudiar las propiedades de un microorganismo dado, es necesario manipularlo en cultivos puros sin otros tipos de microorganismos. Para llevar a cabo esto, debe aislarse una sola célula de todas las demás y cultivarse de forma tal que su progenie permanezca aislada. Se dispone de varios métodos.

A.    Cultivo en placa

Las células en un medio de gel se encuentran en moles.  El agente ideal para la formación de gel para la mayor parte de los medios de cultivo microbiológico es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas rojas. Una suspensión al 1.5 a 2% en agua se disuelve a 100°C, dando origen a una solución clara que se gelifi ca a 45°. Así, una solución de agar estéril puede enfriarse a 50°.

•  método de vertido en placa se mezcla una suspensión de células con agar líquido a 50° y se vierte en una caja de Petri.
  
• Otro método consiste en crear estrías de la suspensión original sobre una placa de agar con un asa de alambre (técnica de estriado en placa), este método es tan fiable y mucho más rápido que el método de vertido en placa.
  
• En la técnica de extensión en placa, un pequeño volumen de suspensión microbiana diluida que contiene 30 a 300 células se transfi ere hacia el centro de la placa de agar y se extiende en forma uniforme sobre la superfi cie con una varilla de cristal estéril, doblada. Las células dispersadas dan origen a colonias

B.     Dilución

Un método mucho menos fiable es el de la dilución hasta la extinción. Se realizan diluciones seriadas de la suspensión y las muestras de cada dilución se cultivan en placa. Si sólo unas cuantas muestras de una dilución en particular muestran crecimiento, se supone que algunas de las colonias iniciaron a partir de una sola célula. Este método no se utiliza a menos que sea imposible el cultivo en placa por alguna razón. Una característica indeseable de este método es que sólo puede utilizarse para aislar el tipo predominante de microorganismo en una población mixta.